Игра является связующим звеном между играми Assassin's Creed и Assassin's Creed 2.

В игре Альтаир охотится на членов Ордена Тамплиеров, которые ушли со Святой Земли на выкупленный у короля Ричарда Кипр. Там, на острове, Альтаир находит новых союзников и врагов, помогает местному сопротивлению тамплиерам и выслеживает их руководителей. Каждому заказному убийству, которое Альтаиру предстоит выполнить по сюжету, будет предшествовать ряд миссий (8 разновидностей). В Assassin's Creed: Bloodlines открываются все непонятные моменты, объясняющие связь между Assassin's Creed и Assassin's Creed 2. В этой части герой может перемещаться и залезать повсюду, что раньше было недоступно на PSP, а для того, чтобы получить доступ к эксклюзивным материалам, достаточно подсоединиться к консоли PS3.